样品制备丨艾美捷硝酸盐/亚硝酸盐荧光法检测试剂盒

一氧化氮（NO）是由一氧化氮合酶（NOS）在生物系统中合成的。NOS是一种非常复杂的酶，作用于分子氧、精氨酸和NADPH，产生NO、瓜氨酸和NADP+。这个过程需要五个额外的辅因子（FMN、FAD、血红素、钙调素和四氢生物蝶呤）和两个二价阳离子（钙和血红素铁。已鉴定出三种不同的NOS亚型，如图所示。

艾美捷硝酸盐/亚硝酸盐荧光测定试剂盒提供了一种简单的两步过程中测量硝酸盐/硝酸盐总浓度的准确和方便的方法。第一步是利用硝酸还原酶将硝酸盐转化为亚硝酸盐。第二步是加入DAN（以酸性溶液形式提供），然后加入NaOH，以增强荧光产物1（H）-萘三唑的检测。测量该化合物的荧光可准确测定NO浓度。

艾美捷硝酸盐/亚硝酸盐荧光法检测试剂盒：

样品制备

该试剂盒已在培养基和血浆中验证。使用以下特殊说明，有必要从这些来源中提纯一些样品。采集后，将样品储存在-20°C或-80°C。

培养基

一些类型的组织培养基含有非常高的硝酸盐水平（例如RPMI 1640）。如果实验的目标是测量硝酸盐水平的微小变化，则这些类型的培养基不应用于细胞培养。细胞硝酸盐/亚硝酸盐的产生可以通过从细胞生长期间存在的硝酸盐/亚硝酸盐总水平中减去培养基中存在的硝酸酯/亚硝酸盐水平（在没有细胞的情况下）来定量。酚红和胎牛血清可显著降低荧光强度。只要可能，这些成分应排除在培养基之外。介质组分对荧光强度的影响必须通过在测定中使用的介质量存在的情况下绘制亚硝酸盐或硝酸盐标准曲线来评估。为了获得最大的信号响应，最好将样本量限制在10或20µl。可以使用更高体积的样品（最终反应体积的30-50%），然而，在这些条件下荧光可以显著猝灭。为了在介质存在的情况下制作标准曲线，只需制备硝酸盐或亚硝酸盐标准曲线（见第15页），用所需的介质量代替测定缓冲液。对于硝酸盐和亚硝酸盐的测量，反应完成需要培养一小时。

血浆和血清

使用市售离心机或微量超滤装置通过10或30kDa分子量截止过滤器对血浆和血清样品进行超滤。这一过程将去除血红蛋白，从而导致荧光强度的急剧降低。使用最多10µl滤液测定硝酸盐和/或亚硝酸盐。硝酸盐转化为亚硝酸盐需要1-2小时，转化率≥95%。

组织匀浆

将样品在PBS（pH 7.4）中均匀化，并以10000 x g离心

20分钟。以100000 x g离心30分钟（100000 x g的离心是可选的，但会增加过滤速率。此外，在超滤之前通过0.45微米过滤器过滤溶液可以提高超滤速率）。通过10或30kDa分子量截止过滤器（用超纯水预冲洗）的超过滤器组织匀浆。使用10µl滤液测定硝酸盐和/或亚硝酸盐。硝酸盐转化为亚硝酸盐需要两小时，转化率≥95%。

艾美捷硝酸盐/亚硝酸盐荧光法检测试剂盒相关文献：

1.Moncada, S. The L-arginine: nitric oxide pathway. Acta Physiol. Scand. 145, 201-227 (1992).

2.Nathan, C. Nitric oxide as a secretory product of mammalian cells. FASEB Journal 6, 3051-3064 (1992).

3.Miles, A.M., Chen, Y., Owens, M.W., et al. Fluorometric determination of

nitric oxide. Methods 7, 40-47 (1995).

5.Miles, A.M., Chen, Y., Owens, M.W., et al. Fluorometric determi4.Misko, T.P., Schilling, R.J., Salvemini, D., et al. A fluorometric assay for the measurement of nitrite in biological samples. Anal. Biochem. 214, 11-16 (1993).nation of nitric oxide. Methods 7, 40-47 (1995).